Vorbereiten der Probe, Test auf Detektion,Test auf Konzentration,
Test auf Fokussierung und auf geeignete mobile Phasen.
Vorbereitung der Phasenflasche, des Transferdochtes, der DC-Platte,
der Dosierwerkzeuge, der Kamera, des Analysencodestreifens.

 

Vorbereiten und Herstellen der Probe
5-100 mg feste Probe mörsern, in µ-PLC Standard-Fläschchen mit 1 ml Ethanol:Wasser 70:30 einfüllen, unter Umständen einige Sekunden unter Ultraschall (Brillenreinigungsgerät ist ausreichend) mögliche Festpartikelchen verteilen. Da die Probensuspension mit Pinsel dosiert wird, ist eine verbleibende Inhomogenität kein Problem. Entscheidend ist, dass die Vergleichsprobe exakt gleichartig behandelt wird Fläschchen kodieren mit Standard-Analysencode:  siehe weiter unten.

Test auf Detektion
Mit einem sachgerecht gereinigten Mikropinsel Nr. 6 eine mehrfach genommene Probenlösung / Probensuspension in eine möglichst dünne Linie (ca 2 - 3 mm breit und so lang gezogen wie möglich) auf eine der zu verwendenden sachgerecht gereinigten DC-Platten Type F254 auftragen. UV-Lampe einsetzen, auch wenn die Probenlösung farbig sein sollte. Je nach dem jetzt sichtbaren Befund entscheiden, ob weiterer Aufwand zum Verbessern der Detektierbarkeit notwendig ist bzw. ob die gewählte Probenkonzentration oder das Probenlösemittel verändert werden muss.

Test auf Fokussierbarkeit und auf geeignete mobile Phase(n)
An der wie oben erzeugten Probenlinie wird zunächst geprüft, ob Methanol, oder Aceton oder Methylenchlorid als Fokussierflüssigkeit einsetzbar ist. Das geschieht mit dem sachgerecht gereinigten und mit F-Flüssigkeit beladenen Mikropinsel 6, indem (unter UV Licht 254 / 366 nm) die Pinselspitze an den Rand der Probenlinie auf der DC-Schicht gehalten wird. Gelingt die Fokussierung, dann wird erst die eine Seite der Probenlinie mit der Fokussierflüssigkeit und nach Trocknung die andere Seite  im Abstand von etwa 1 mm seitlich zu einer schliesslich scharfen Probenlinie verformt, wie im Bild unten gezeigt. Die geschärfte Probenlinie muss vollständig von der Fokussierflüssigkeit getrocknet werden, ehe die Tests auf geeignete mobile Phasen folgen. Wiederrum mit dem jeweils vollständig in  den Testphasen gereinigten und beladenen Mikropinsel 6. Man geht zweckmäßig so vor wie ein Aquarellkünstler, der mit nur einem Pinsel hintereinander blau und gelb malt ohne grün zu bekommen. Mehrfach hintereinander spülen, Saugpapier benutzen, wiederholt mit der zu prüfenden mobilen Phase beladen. Auch auf Test Plattenbereichen zum 100%igen Umstellen gewechselter mobiler Phasen einsetzen. Die Codierung der verwendeten Phasen bzw. in Mikrofläschchen per Hamiltonspritze genau hergestellter Phasengemische wird durch Anwendung der “Halpaap-Tabelle” als Polaritätszahl erleichtert und ist per Digitalphoto wie im Bild unten dargestellt gut genug protokollierbar. Jeder höhere Aufwand bei der Phasenoptimierung ist ebenfalls machbar aber meistens überflüssig. Zur Halpaap Tabelle clicke HIER und wähle dann Bild 19.

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Im Bild oben wurde mit einer Spur roter Testfarbe in Methanol festgestellt, dass die Fokussierung der zunächst breiten Probenlinie gelingt. Danach wurde mit Methanol (Halpaap 27) OHNE Testfarbstoff die breite Probenlinie längs eingeengt - erst oberhalb, dann nach Zwischentrocknung unterhalb. Sodann konnte mit den mobilen Phasen  24 = Ethanol, 23 = Azeton, 12 = Dichlormethan, 9 = Toluol, 2 = Hexan folgendes gefunden werden: bis auf  die auch  mit 23 nicht laufende orangene Substanz ist 9 die offenbar beste 100 %-Phase. Mit Hexan läuft keine einzige Substanz und ob Mischungen 9 mit wenig 12 oder 9 mit wenig 2 Verbesserungen bringen, muss in einem größeren Circularlauf geprüft werden, jedoch stets nur auf gereinigten DC-Platten. Ob dabei ein Lauf mit einer Mischung oder eine Reihe Trennläufe mit Zwischentrocknung und von 27 in Richtung 2 absinkender Elutionskraft auf Kieselgel genügend Information für Produkt-Vergleichsanalysen liefern, ist Sache einer Serie vollständiger Trennläufe.

Vorbereitung der Phasenflasche
Weil in einem Volumen von nur 1000 µl schon ein restlicher Tropfen  einer vorherigen mobilen Phase messbare chromatographische Verfälschung bewirken kann, muss die Phasenflasche richtig gereinigt werden: am zuverlässigsten mit strömender Luft aus der Mini-Gaspumpe. 2 L/min machen je nach Flüchtigkeit der Restflüssigkeit die Phasenflasche in Minuten methodengerecht sauber. Es ist zu hoffen, dass Sie mobile Phasen haben, welche keine un- oder schwerflüchtigen Rückstände enthalten. Die stören auch eine manuelle Multi-Trennung. Die µ-PLC stellt solche schweren Qualitätsmängel an mobilen HPTLC Phasen empfindlich fest, wenn die 1-ml-Dosierung angewendet wird wie folgt: “1 ml” Phase unter Gasströmung auf eine (gereinigte) Platte dosieren, zu einem scharfen Ring fokussieren, trocknen. Diesen Ring auf chromatographierbare Bestandteile prüfen. Das ist ein scharfer Test auf DC-gerechte mobile Phasen. Gibt es fast nicht zu kaufen. Erforderlich könnte eine Destillation sein unter Anwendung reinen Paraffins als “Sumpf” im Destillierkolben.

Vorbereitung des Phasentransferdochtes
Der Transferdocht besteht aus gewickeltem Baumwollflies. Er steckt rutschfest in einem kurzen Stück Rohr aus PTFE, 5.0 mm Außendurchmesser, 3 mm lichte Weite und ist am inneren Ende des PTFE-Rohres mit einem kurzen Stück 0.3 mm hartem Stahldrahtes festgeklemmt, um beim Aufsetzen des Phasentransfersystems nicht ins Flascheninnere zu rutschen. Das vordere Ende des Dochtes muss etwa 0,2-0,6 mm aus dem PTFE-Rohr herausragen. Nach Gebrauch ist der Docht mitunter noch durchgehend mit mobiler Phase benetzt. Das würde den nächsten Trennlauf grob verfälschen. Daher muss der Docht mit 2 L/min Luft aus der Mini-Gaspumpe trockengeblasen werden . Das ist je nach Phasenflüchtigkeit in wenigen Minuten erledigt. Dazu ist ein Schraubinterface zweckmäßig wie im Bild unten gezeigt.

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Eine Mikroflasche wurde am Boden aufgeschnitten, ein PTFERohrstück eingesetzt und mit einem Heißkleber gasdicht eingepasst. Da der Transferdocht mit dem PTFE-Rohr in die schwarze Plastikverschraubung - ebenfalls gasdicht - eingeklemmt ist, passen die Gewinde perfekt. Man könnte den grünen Plastikschlauch der Gaspumpe auch direkt auf das offene Ende des Transferdocht-Rohres aufstecken, würde damit aber Verunreinigungen gerade an der Kontaktstelle mit der DC-Platte nicht sicher vermeiden. Daher dieses sehr einfache aber funktionierende Interface.

Vorbereitung der DC-Platte
Jede stationäre Phase muss vor der Dosierung, Fokussierung und Trennung gereinigt werden. Die circulare Reinigung am besten mit der später verwendeten Fokussierphase ist fast immer ausreichend, auf jeden Fall aber viel qualifizierter als klassische Reinigungsmethoden. Es ist bei einigen Plattenarten notwendig, außer z.B. nur mit Methanol - falls dieses das Fokussiermittel sein wird - noch mit einer weiteren mobilen Phase zu reinigen. Das geschieht so wie bei einer nachfolgenden Trennung: das Phasenfläschchen wird exakt im Zentrum auf die analytische DC-Platte aufgesetzt, nachdem es auf einer weiteren (Test)-Platte im Deckglas sitzend in den konstanten Laufzustand gebracht worden ist. Das kostet einige Sekunden. Das Anlaufen des Phasentransfers erfordert natürlich zuerst die Entfernung der Luft im Docht. Man bewirkt dies auf der (Test)-Phase mit ein wenig Anwärmen des bereits aufgesetzten Mikrofläschchens, das für den Anlaufvorgang wenig mehr als 1 ml Flüssigkeit enthalten soll. Das Totvolumen des zunächst trockenen Dochtes liegt bei etwa 80 µl. Das angelaufene Phasenfläschchen mit Docht wird durch eine rasche Umsetzung komplett mit dem Deckglas exakt auf das Zentrum der analytischen Platte gesetzt, wobei die drei Aluminiumstutzen Präzision bieten. Man lässt die gesamten 1000 µl in die Platte laufen und trocknet danach aus dem Zentrum mit Luft aus der Gaspumpe. Die Verdunstungswärme der Reinigungsphase bewirkt zwar zunächst ein Absinken der Plattentemperatur um 1..3 Grad C, aber die Masse und Wärmekapazität der Arbeitsplatzplatte und die ein wenig wärmer als Raumtemperatur aufströmenden 30 Liter Trockenluft bewirken keine Probleme mit der schließlichen Trenntemperatur. Immerhin wird ja nach der Plattenreinigung und Trocknung noch dosiert, Probenlösemittel weggetrocknet, fokussiert, Fokussierflüssigkeit weggetrocknet und erst dann der chromatographische Trennlauf gestartet. µ-PLC ist eine eher gemächliche Methode. Ruck-Zuck Arbeitsweisen übersehen Gleichgewichtseinstellungen....

Vorbereitung der Dosierwerkzeuge
Überwiegend besteht das Haarmaterial der Mikropinselchen aus Tierhaar. Hitze wird vermieden. Die Pinsel werden im Prinzip so gereinigt, wie die Aquarellmaler das machen: kräftig ausschütteln in einem Überschuss an Flüssigkeit. Die Flüssigkeit richtet sich nach dem aufzutragenden Produkt: Wenn Probensuspensionen aufgetragen werden sollen, die in Ethanol/Wasser 70/30 gelöst oder aufgeschwämmt wurden, ist Ethanol/Wasser die geeignete Flüssigkeit. Durch einen ausreichend langen Kontakt der Pinselspitze mit einer (trockenen) Testplatte - etwa 15 bis 20 Sekunden lang - wird der Pinsel mindestsn so trocken wie durch Ausdrücken in porösem Papier. Nichtimprägnierte Papiertaschentücher zusätzlich anzuwenden ist nützlich.
Damit die Probenkonzentration nicht verfälscht wird, wechselt man 3-5 mal die Pinselposition in der Probenlösung und auf der Testplatte. Das gilt auch für den Fokussierlauf.
Informativ ist ein wenig Training mit Farblösungen. Ab welchem Wechselaufwand - Beladen / Entladen des Pinsels ist der anfangs aufgenommene Farbstoff nicht mehr auf der Testplatte zu sehen ? Im UV Licht (Schutzbrille !) ist diese ausreichend gute Pinselreinigung bzw. Umstellung von Probenlösung auf mobile Phase gut festzustellen. Wenn es auf Spurenanalytik mit stark sorbierenden Proben ankommt sollte man sich daran erinnern, daß ein Mikropinsel um 50 cent kostet. In der GC-Spurenanalytik mit stark sorbierenden Substanzen wird der Verschlepp- und memory-Effekt beim Wechsel von einer höher konzentrierten  Kalibrierlösung gegen die gering konzentrierte Analysenlösung durch Spritzenwechsel entschärft. Warum also nicht auch in der µ-PLC, die bis in die ppt-Analytik reichen kann !!!

Vorbereitung der Kamera
Weil mitunter die Dosierflecken, die fokussierten Bögen oder Kreise auch mitten in Trennläufen photographiert werden sollen - sekundenschnell, um die Trennfläche in das Bild zu bekommen, sollte die Kamera stets funktionsfähig vorbereitet sein. Bei Anwendung von UV-Licht aus einer an den DC Plattenrand gelegten CAMAG-UV-Lampe muss die Deckglasplatte mit dem Phasentransfersystem hochgenommen und auf die Testplatte gelegt werden. Um das sekundenschnell durchführen zu können sollte folgendes  eingestellt sein:
die Bildschärfe auf 100 mm Abstand Linse zu PLC-Fläche (entweder per AUTOFOCUS oder - wenn ein Auflagekorb existiert . fest eingestellt (falls Ihre Kamera das im 100 mm Bereich erlaubt)
Ferner: die Lichtempfindlichkeitseinstellung und die Unterdrückung oder eine Zwangsauslösung des Flashlichtes. Geprüft sein sollte eine ausreichende Speicherkapazität des Graphikchips. Weitere Voreinstellungen der Digitalkamera können zweckmäßig sein je nach Kameratyp. Eine Kamera der Art Sanyo Modell Xacti VPC E6EX z.B. hat über 100 digital einstellbare Funktionen, sodaß eine ausgedruckte Befehlssammlung griffbereit verfügbar sein sollte, wenn man noch nicht trainiert ist, optimal digital zu photographieren. µ-PLC kann mitunter sofort Informationen liefern falls man mit der Kamera gut umgehen kann. Anders als in der eindimensionalen Säulen- oder Kapillar-Chromatographie sieht man bei der µ-PLC u.U. Wichtiges nur life. Die Planar-Chromatographie ist eben keine Ein-Knopf Technik, bei der wie in neuesten Funktionsbeschreibungen modernster Analysensysteme zu lesen ist wonach zum “Fully automated measurement, analysis and reporting accomodating any SOP” noch erläuternd steht : “No (XRD) knowledge required”. Chromatographeure sollten knowledge einsetzen denn deren Technik ist analytisch ungeschlagen leistungsfähig, wenn man sie beherrscht.

Vorbereitung des Analysencodestreifens
In der Praxis gibt es zahlreiche Regulierungen über die Codierung von Proben, Methoden, Verfahren, Analysenabläufen. Viele Jahre Erfahrung ergaben, dass sich die folgende Codierung optimal verhält, auch wenn nicht nur einzelne Analysenstellen sondern komplexe Laboratorien zusammenarbeiten.
Da die Wahrscheinlichkeit gering ist, dass exakt zur gleichen Minute gleichartige Probleme im Nachbarlabor oder der Nachbarapotheke bearbeitet werden und weil auf Jahre zurück mitunter Vergleiche notwendig werden, gilt folgendes Codierungsprinzip als sicher: Es wird zweistellig das Jahr (08-99), der Monat (01-12), der Tag (01-31), die Stunde (00-23), die Minute (00-59) im Augenblick vergeben, wenn die Analyse beginnt und es werden drei bis vier alpha-Zeichen für die Probe, den Ort und die Art der Analyse angehängt. Dieser Code steht auf dem Fixierband, welches die DC-Platte auf dem 30 x 40 cm große Arbeitsbrett des µ-PLC Systems rutschfest befestigt. Wird mit der Platte nicht mehr weiter gearbeitet, wird das Fixierband nach hinten geklappt und auf die Rückseite der Plastik-, Alu oder Glasplatte festgedrückt. Die Vergabe des Codes geschieht fast zeitgleich an zwei Stellen: auf dem Fixierband und im Datensystem des PLC-Rechners, zweckmäßig in einer Tabelle wie MS-WORKS. Sortiert gibt der Gesamtdatensatz den zeitlichen Ablauf von Untersuchungen sicher wieder. Man kann diese Sache überregulieren, erhöht damit wesentlich die Kosten und gewinnt keinen Nutzen hinzu. Die sachliche Eleganz steckt in den Details der alpha-Anteile des Codesatzes. Der Analysencodestreifen soll mitphotographiert werden, wenn das Chromatogramm dokumentiert wird oder muss, wenn unter UV oder Flu aufgenommen wird, sofort in den Graphikdatensatz und die Works-Tabelle übertragen werden
Beispiel: 0809062228REKHIS = REKHIS Projekt am 6. September 2008. Alle entscheidenden WWWWW Details zu was, wann, wo, (für) wen, warum, (und) wie steht unter 0809062228REKHIS auf einem “automatisch updatebaren und synchronisierten Datensystem. Es wird uns im Laufe der Jahre noch Weiteres zur Verfügung stehen. Derzeit ist das Apple-Konzept als www.me.com mit der “Datenwolke” interessant, obwohl dabei allerdings nahezu alles auch in dritte Hände kommt.

An die Vorbereitung schliessen sich an:  das Auflegen und Fixieren der DC-Platte präzise an drei Alu Stutzen, das Befüllen eines Mikrofläschchens mit der Reinigungspgase z.B. mit 1.1 ml Methanol wasserfrei, das Anlaufenlassen der Phasenflasche mit aufgeschraubtem Docht auf einer Testplatte und schliesslich das Aufsetzen der Phasenflasche komplett  in das Deckglas auf die zu reinigende DC-Platte. Siehe das Bild unten.
Nach etwa 12 Minuten (bei 20 Grad C) ist das Methanol weit genug vorangekommen. Das Phasenfläschchen wird aus der Glasplatte herausgenommen und die Gaspumpenleitung in das zentrale Loch mit schon laufender Trocknungsluft eingesetzt. Die noch Flüssigkeitsreste enthaltende Mikroflasche wird in eine auf der Testplatte liegende Glasdeckplatte eingesetzt und so weiter ...

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