Die Circularsoftware SORBFIL V. 2.0 besitzt so viele weitere Möglichkeiten, den gesamten Quantifiziervorgang in allen Einzelheiten zu prüfen und zu überwachen einschliesslich einer Korrektur möglicher ungleichförmiger Plattenbelichtung, dass dieser Funktionsumfang nur in HELPfiles des software-Pakets zu beschreiben ist. Um optimal mit dieser neuartigen software arbeiten zu können und die Vielfalt ohne Verlust von Qualität zu minimieren, ist ein Tutorial zweckmäßig. Wir prüfen, wie der Interessent mit der Quantifizierung von Circular Chromatogrammen optimal vertraut gemacht werden kann. Der zugehörige Aufwand für Autoren ist allerdings hoch. Das erhöht die Softwarekosten beim Programmierer nicht, aber bewirkt Zusatzkosten, für die eine Vereinbarung zwischen dem Benutzer und dem Autor zweckmäßig ist.


 Ein weiteres Anwendungsbeispiel:
Reinheitsvergleich von zwei angeblich “gleichen” Testsubstanzen - im Folgenden aus bestimmten Gründen als “ Testsubstanz “ ‘a’ und ‘b’  bezeichnet.

Es wurde mit µ-PLC auf eine Platte so dosiert, dass ein jeweils kleiner Probenanteil ‘a’ mit ‘b’ überlappt wird. Im Chromatogramm liegt der Überlappungsbereich am unteren Teil des Chromatogrammbogens. Es liegen nur drei Proben vor: ein Farbstofftest und Teststoff ‘a’,‘b’.Es gibt keinen Anlass anzunehmen, dass ‘a’ stofflich nicht gleich ‘b’ ist - siehe das Chromatogrammbild unten.

Das Chromatogramm wurde mit einer digitalen Kleinbildkamera photographiert. Unter ‘Sorbfil Version 2’ wurde einmal links mit N = 6 im Bereich ‘a’ und dann rechts mit N = 6 im Bereich ‘b’ unter UV 254 nm multi-integriert. Beim Vergleich der quantitativen Werte aus der relativen Position der Substanzbögen = Pr (Positions-%)  mal Integral der Peakflächen ergab sich, dass die (ohne stoffspezifische Korrekturfaktoren) berechneten Substanzgehalte im rechten Chromatogrammbereich einen Ausreisser enthielten - in der Tabelle unten grün gekennzeichnet. Mit einem kBasic Programm zur Prüfung auf Ausreisser (outlier, runaways) wurde festgestellt, dass nach den Regeln des ‘Nalimov-Ausreissertests’ der zu kleine quantitative Wert hochsignifikat also mit 99.9 % statistischer Wahrscheinlichkeit als Ausreisser aus dem Datenmaterial ENTFERNT werden MUSS.

Nun sollte man sich nicht wundern: auf HPTLC Flächen darf durchaus ein Schichtfehler, ein eingelagertes Haar oder sonst die Quelle eines lokalen Fehlsignals liegen. Ausreissertests in der quantitativen HPTLC - also auch der quantitativen µ-PLC - sind ein notwendiges statistisches Kontrollwerkzeug. Fast jedes Planar-Chromatogramm hat Ausreisser. Und jeder Analytiker, der Dünnschicht-Chromatographie kennt und kann, wendet Ausreissertests an. Oder ?

Die +- 0.1 % relative Vergleichsstandardabweichung sind ein Hinsehen wert. Es spricht für die quantitative µ-PLC, die Photodigitalisierung und die verwendete Multi-Integrations-Software.
 

Die Voraussetzung zur Quantifizierung circularer Chromatogramme ist eine geeignete SOFTWARE.
Erst mit Digitalkameras aufgenommene µ-Chromatogramme konnten
qualifiziert ausgewertet werden. Die Auswertung basiert auf mehrfacher Integration von circular verschobenen Chromatogramm-Bändern. Dabei gelang die grundsätzlich notwendige Reduktion der Struktursignale in der Dünnschicht-Chromatographie. Dies führt zu bislang unbekannt kleinen Vergleichsstandardabweichungen um häufig unter +- 0.5 %.
NEU 2015: Inzwischen gibt es die weiter verbesserte software Version SORBFIL 2.5
 

Einige Bilder sollen im Folgenden Begriffe wie Quantifizierung circularer Chromatogramme, mehrfache Integration von circular verschobenen Chromatogramm Bahnen und das Problem Plattenstruktur leichter verständlich machen.
Weil seit Jahrzehnten die Quantifizierung linearer Dünnschicht-Chromatogramme mit Scannern die regulierte Praxis ist und weil von Anbeginn der Scannerquantifizierung die Plattenstruktur als Signalrauschen rein mathematisch-statistisch behandelt wurde, ist das Problem Plattenstruktur wenig beachtet worden. Durch Plattenvibration im Scanner ist es auch experimentell als nicht  korrigierbar fehlbewertet worden. Plattenstruktur ist ein stabiler plattenabhängiger Zustand, kein Signalrauschen. Letzteres gibt es natürlich auch. Es ist etwa zehn mal kleiner als das Struktursignal.

Mit Sicherheit steht fest, dass die Plattenstruktur ein örtlich fester mechanischer Zustand ist, hervorgerufen durch die lokal ungleichförmige Schicht mit ihren doch relativ ungleichen Partikelgrößen. Die messbare absolute Signalgröße der Plattenstruktur ist abhängig von der Wellenlänge, mit der die Plattenoberfläche beim klassischen Scannen (vom Scanfensterchen her) belichtet wird. Wird die Platte digitalphotographiert, muss sie ebenfalls beleuchtet
werden. Ob mit Bltzlicht, mit einer UV-oder mit einer VIS- oder IR-Lampe: die Plattenstruktur -nicht aber ihre absolute Signalstärke beim Scannen - bleibt örtlich konstant Sie hat mit einem Signal, das durch Lichtabsorption oder Lichtemission von in und auf der Schicht befindlichen chemischen Stoffen entsteht, nichts zu tun. Allerdings überlagern sich die Struktur- und Substanz-Signale. Da die Struktursignale die Messwerte verfälschen, müssen sie beseitigt oder zumindest deutlich reduziert werden. Bislang erfolgt dies nach mathematisch-statistischen Konzepten, die generell zur Rauschminderung oder Signalglättung eingesetzt werden. So dürfen aber systematische Signalverfälschungen nicht behandelt werden. Wiederholt: Die Plattenstruktur hat mit Rauschen nichts zu tun, sie ist ein systematisches Falschsignal - falsch bezogen auf die Stoffe im Chromatogramm.

Der Einfluss der Plattenstruktur auf die quantitative Planar-Chromatographie ist erheblich. Er ist ein Hauptgrund für die allgemein beklagte geringe Präzision von TLC- bzw. HPTLC Analysenwerte. Eine Kalibrierkurve im ng-Bereich von z.B. Lebensmittelfarbstoffen vermessen  mit klassischem Scannen kann im Mittel über den gesamten Konzentrationsbereich eine Wiederholstandardabweichung von +- 4 % zeigen, wenn die Plattenstruktur als Rauscheffekt behandelt wird. Beseitigt man das Rauschen RICHTIG, verbessert sich die Wiederholstandardabweichung um eine ganze Größenordnung auf +- 0.4 %. Erst jetzt können Konzentrationen erfasst werden, die um eine ganze Größenordnung niedriger liegen. Der quantitative Analysenbereich wird so um einen Faktor 10 breiter.

Die quantitative µ-PLC ist deswegen so unerwartet präzise, weil die vom IfC zusammen mit SORBFIL entwickelte Circular-Auswertesoftware die Plattenstruktur durch “gemittelte Multiintegration” reduziert.

Das funktioniert so: Über einen festgelegten Winkelbereich werden mindestens vier, besser zB 8 Scanbahnen integriert, die um z.B. je ein Grad Winkel weitergedreht bei fest eingestellter konstanter Breite überlappen. Die einzelnen Bahnsignale werden addiert. Sie enthalten alle die von Substanzen und von der Plattenstruktur bewirkten Signalanteile, es handelt sich somit um Rohsignale.

Da die Plattenstruktur von Ort zu Ort unterschiedlich ist, die Substanzmenge entlang einer Kreislinie oder innerhalb eines Bogens aber von der genauen Winkelposition unabhängig gleich ist, reicht das einfache Mitteln der Rohsignale aus. Wurden vier Bahnen winkelverstellt integriert, ist das Signalintegral geteilt durch vier so groß wie in nur einer Bahn. Nicht so das Struktuirsignal. Es sinkt auf ein Viertel. Natürlich muss gelten, dass die Probe homogen war und optimal dosiert wurde und dass genau so ideal die Fokussierung verlief. Auf jeden Fall homogenisiert die Fokussierung die örtliche Substanzverteilung. Dosierung und Fokussierung haben jedoch nichts mit der Plattenstruktur zu tun. Diese bleibt örtlich inhomogen. Bei 8 oder 16 winkelverschobenen Integralbahnen wird das 8 fach bzw. 16 fach angestiegene Substanzsignal durch 8 oder 16 geteilt, ebenso das jeweilige Struktursignal. Das wirkt sich jetzt aber nur noch ein achtel oder ein sechzehntel stark im Endergebnis aus.Und so ergeben sich die zunächst ungeglaubten aber von den Programmierern erwarteten Präzisionsdaten der quantitativen circularen µ-PLC. Hinweis: hier wirken keine Unlinearitäten. Es liegt ja keine 16 fache Substanzmenge bei dem sechzehnten Datenblock vor, sondern ein einfacher rechnerischer Summenwert. Und der wird eben als Zahl durch 16 geteilt. Das ist streng linear !!

Viele quantitative Experimente waren notwendig, bis wir glauben konnten, dass richtig ausgeführte Circularchromatographie tatsächlich so präzis konstante Substanzmengen auf den Bogenlinien liegen hat. Genau so überraschend war eine extrem gute Präzision der Pr-Werte, was weiter unten in Tabellen gezeigt wird - allerdings vorausgesetzt, dass qualitativ hochwertiges Plattenmaterial eingesetzt wurde. Schnell lässt sich durch ein Cicularchromatogramm mit nur einer Probe exakt ins Zentrum dosiert zeigen, wie lokal ungleich die Schichtdicke unqualifizierter Dünnschichtplatten vorliegen kann. Dann sind die bislang extrem guten quantitativen Werte nicht erreichbar. Mit schlechten Platten, einer fehlerhaften Dosierung und unqualifizierter Fokussierung kann auch in der µ-PLC die bekannt mangelhafte Datenqualität heutiger TLC-Messungen erreicht werden.

 

Bild 1: Im Bild links sind vier Integrationsbahnen zu sehen, die auf je einem anderen Winkel stehen und sich ab dem halben Substanzbogen überlappen. Der am oberen Ende der Integrationsbahn 1 erkennbare grüne Punkt lokalisiert den
Pr-Wert 0 - die Frontgrenze des Circularchromatogramms, im Photo nicht erkennbar. Das Zentrum der Platte ist mit einem roten Punkt kenntlich. Beide Punkte werden mit der Maus im digitalen Chromatogrammphoto festgelegt, Um den roten Punkt herum erzeugt die Circularsoftware die vier Integrationsbahnen.

 

 


Bild 2: Per software-Befehl werden die Integrationsbahnen in einer nächsten Bildschirmseite senkrecht gestellt und es wird festgelegt, welche der Bahnen in welchen Grenzen integriert werden soll. Im hier gezeigten Beispiel wurden alle vier Bahnen gewählt - es entstehen FÜNF Datenreihen , die fünfte ist der Mittelwert der vier integrierten Bahnen. Das analoge Bild kann sich der Analytiker ansehen, kann es aber auch überspringen. Durch Softwarebefehl werden nun alle fünf Digitaldatengruppem und alle analogen Zwischenbilder in eine Exceldatei geschrieben.

 


Bild 3: Links sind fünf Chromatogramme als Ergebnis der Integration an 4 unterschiedlichen Winkelpositionen und als Ergebnis der Mittelung dieser vier Resultate ist auch das gemittelte - Chromatogramm als fünftes Resultat in der Graphik untergebracht. Die digitalen Ergebnisse stehen in einer Exceldatei, die auch gleich fertig für einen e-mail Transfer formatiert ist. Selbstverständlich gibt es vom Kamerarauschen bis zum Signalrauschen die Notwendigkeit, mit statistisch-mathematischen Methoden die Chromatogramme zu glätten. Das geschieht aber so, dass die Pr-Positionen NICHT verfälscht werden.  

fig11-fin
fig12-fin
fig13-fin

Die Tabelle oben enthält die Pr-Werte. Im Bild stehen zwar noch Rf-Werte, das Programm wird aber u.U. mit Version 2.1 diese Diskrepanz beseitigen. Die Zahlenwerte bleiben. Nur handelt es sich nicht um richtige circulare Rf-Werte, dazu müsste die Fokussierposition b erücksichtigt werden. Track 1 - 4 enthält die Daten der vier Vergleichs- Chromatogramme. Track 5 ist der Mittelwert aller vier Tracks.
Die S-Tabelle enthält die einzelnen Peakflächenintegrale Track 1 - 4. Track 5 ist der zugehörige und mit nur noch 25% der Plattenstruktur belastete Mittelwert. Die H-Tabelle enthält die Peakhöhenwerte.
Da die Tabelle in einem aktiven Excelformat vorliegt, ist durch den üblichen geringen Tip-
Aufwand jede Art sinnvoller Folgewert berechenbar. So können sekundenschnell interessierende Statistik-  oder Vergleichswerte berechnet und in die Tabelle eingetragen werden. Abgebildet ist nur die Zusammenfassung der Daten. Für jeden einzelnen Track - also jede einzelne Integrationsbahn - ist das Chromatogramm und sind die Peakflächen-Prozentwerte eingetragen, die man sich einzeln oder in Summe ansehen, ausdrucken oder per mail versenden kann.
Für jeden einzelnen Track kann man sich - wenn entsprechend befohlen - die Rausch-geglättete Chromatogrammbahn ansehen. Die Intensität der Rauschglättung ist in mehreren Stufen einstellbar und unmittelbar am rohen und am geglätteten Chromatogramm gezeigt - wenn man das sehen will. Das Grundkonzept der Circularen Quantifiziersoftware ist - wie schon erwähnt - alles Zweckmäßige zu erfassen, zu berechnen und zu zeigen, wenn man das verlangt.
Somit ist das SORBFIL V 2.0 Paket zugleich ein ausgezeichneter Lehrer, der zeigt (und trainiert), wie das PLC Digitalphoto zum Analysenbericht wird.

Bild 4: Das Chromatogramm rechts zeigt fünf exakt übereinander liegende Linien. Es geht um ein Circularchromatogramm mit  ähnlicher Testprobe wie oben, jetzt aber in den Grenzen der für µ-PLC möglichen Präzision dosiert, fokussiert und getrennt. Vier Chromatogrammlinien stammen von um je 1 Winkelgrad verschoben überlagerten gleichbreiten Integrationsbahnen und das Chromato- gramm als fünfter Kurvenzug nach Mittelung. Die Fokussierung der Dosierung erfolgte doppelt: in der ersten Stufe wurde der runde Dosierfleck aus seinem Zentrum heraus in einen schrfen kleinen Ring fokussiert, es wurde getrocknet. Beim zweiten Fokussierlauf wurde dieser Ring in einen scharfen Bogen fokussiert. So entsteht eine positionsunabhängige Mengengleichheit in der Bogenlinie.

bild-1neu

Eine so scharfe Übereinstimmung von vier Chromatogrammen deutet auf eine sehr gute Gleichheit der quantitativen Daten UNTERSCHIEDLICHER Chromatogrammtracks hin. Denn ein voller Winkelgrad Positionsunterschied ist groß genug um festzustellen: hier liegt keine Wiederholbarkeit vor, sondern es geht um Vergleichbarkeit. Somit können wir die Standardabweichung von Messbahn-Vergleichen berechnen - wir erhalten die Vergleichsstandardabweichung. Sie ist kritischer als eine Wiederholstandardabweichung. Mit N = 4 entspricht sie zudem dem Aufwand-zu-Nutzen Optimum nach Gottschalk. Hier folgen die digitalen Rohdaten = Pr-Werte und Peakflächen, wie sie die µ-PLC Circularsoftware in eine Exceltabelle schreibt, wenn dazu der entsprechende software-Befehl gegeben wird (ein Click mit der Maus an die richtige Stelle). Die Tabelle gehört zu den analogen Daten in Bild 2 und 3 oben.

plctable

Abschliessend von einem analytischen Standardfall ohne besonderer Vor-und Nachbehandlung ein fast komplettes Datenbeispiel mit dem Hinweis, wie die Statistikwerte in dem Excelfile aussehen. Zuerst folgt ein Einzelblatt zum Track Nr. 4 und die analogen und digitalen Daten:

xsl-dat a

Hier folgt der zusammengefasste Bericht mit eingefügter Statistik. In FETT die strukturreduzierten Mittelwerte.
Peakflächen-Vergleichsstandardabweichung +- 0.5%; Peakhöhen +- 0.4%

xsl-data b

Abschliessend die graphische Zusammenfassung: so gleichartig sind die 4 Chromatogramme der winkelverschobenen Integration und der Mittelwert als 5. Chromatogramm. Die Linien liegen so scharf aufeinander, dass Unterschiede bei dieser Bildgrößenwiedergabe nicht erkennbar sind.

xsl-data c

Unter optimalen Bedingungen wurden Werte von +- 0.05 % erreicht

Rp-Werte

Bogen 1

Bogen 2

 

Bogen 1

Bogen 2

 

Track 1

0.26

0.74

 

0.20

0.68

 

Track 2

0.26

0.75

 

0.20

0.68

 

Track 3

0.27

0.75

 Probe ‘a’

0.21

0.68

Probe ‘b’

Track 4

0.27

0.75

 

0.21

0.69

 

Track 5

0.27

0.76

 

0.21

0.70

 

Track 6

0.27

0.76

 

0.22

0.70

 

Peakflächen

 

 

Fläche 2 %

 

 

Fläche 2 %

Track 1

979

15870

97.879

1426

15848

97.422

Track 2

916

15554

97.999

1411

15401

97.376

Track 3

893

14814

97.876

1444

15841

97.262

Track 4

919

14444

97.761

1497

16577

97.325

Track 5

942

14834

97.794

1699

17396

97.153

Track 6

979

15226

97.761

1991

17695

96.584

 

 

Mittelwert

97.846

 

Mittelwert

97.308

 

 

Standabw.

0.091

 

Standabw.

0.105

 

 

+- RSD %

0.09 %

 

+ - RSD %

0.11 %

Die Flächen-Prozentwerte ergeben sich aus Rp-Wert mal  Rohwert der Peakfläche 1 plus 2.
[ Peakflächen-%-Wert 2 mal Rp-Wert 2 ] * 100 / Summe (Rp-Wert 1 mal Flächenwert 1 plus Rp-Wert 2 mal Peakflächenwert 2 ) = Peakwert 2 in Prozent. Zum Beispiel  96,584 %
(in der Tabelle oben, rechts, 14. Zeile, in grün).
Da aber 6 Flächen-%-Werte von 97.422 bis 97.153 vorliegen, ist auf Grund des Mittelwertes und des RSD-% Wertes das Ergebnis 96.584 % ein hochsignifikanter Ausreisser nach Nalimov. Mit einem kleinen KBasic Statistik-Programm lässt sich dies sekundenschnell feststellen. “Zu Fuß” wäre der Rechenaufwand zu groß.

Warum unterscheiden sich die Rp-Werte der Probe ‘a’ zu ‘b’ ? Es ist ohne Bedeutung, wo genau der Rf-Wert 1.00 des letzten Trennlaufes liegt. Somit kann manuell die Position der Phasenfront im Zirkularchromatogramm fast beliebig gewählt werden, das geschieht auch im Zirkular- Multi-Integrationsprogramm. Kein Problem: die qualitativen Positionswerte ausgedrückt als Relation [Circularzentrum zu Substanzposition] geteilt durch die Strecke ‘[Circularzentrum zu einer ungefähren Position der letzten mobilen Phasenfront] ist ein perfektes Mass für die Relation der qualitativen PLC-Werte, wird aber exakt so für die quantitative Auswertung eingesetzt. Zirkular-PLC hat mehrere entscheidende Vorteile gegenüber der Linear-PLC bei der quantitativen Auswertung, ganz anders als einige Fachkollegen ohne PLC-Praxis meinen. Sie erlaubt quantitative Absolutanalytik, weil die Abtaststrecke des Integrationsprogrammes für jede Bogenposition absolut gleich und konstant ist. Somit gilt: die relative Gesamtmenge Substanz X = 2 pi mal Kreisradius. Und schon ist die genaue Position des Startringes für die Substanz X genau so unwichtig wie die genaue Position des Phasenfrontringes, allerdings die Position des Chromatogrammzentrums ist genau und richtig zu ermitteln. (Der Autor hat auch erst mal gestaunt, warum das so und so einfach ist). Siehe in englisch in dem freien e-Buch www.planar-chromatography-by-kaiser.com im Abschnitt Multi integration.

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