Mikro-Planar-Liquid-Chromatography =  µ-PLC: 
  eine neue planar-chromatographische Methode insbesonders zum sicheren
  und kritischen VERGLEICH von Proben.

Praktische Arbeitsweise:

Nach der Trennung - notfalls mit mehreren Phasen nacheinander - nass in nass oder trocken - mit raschem Wechsel der mobilen Phasen - wird mit strömendem Gas aus dem Zentrum getrocknet, unter optimal gewähltem Licht digitalphotographiert - und die Daten vom photochip in die (ebenfalls grundsätzlich neuartige) Circular-Auswertesoftware geladen.

Die Quantifizierung erfolgt auf in der Breite festgelegter Bahn schnell  mit mehrfach exakt verschobenem Winkel der Auswertebahn. Die Integrale werden gemittelt und so der klassische systematische Hauptfehler der DC deutlich reduziert. Diese Technik führt zu bisher unbekannt guten quantitativen Resultaten mit einer großen Freiheit von spezifischen Detektionsmethoden. Die Software für eine digitale Bildbehandlung ist im Internet  frei verfügbar. Sie hat ein ausgesprochen gutes Preis-Leistungsverhältnis.

Die hardware eines kompletten µ-PLC Arbeitsplatzes von etwa 30 x 40 cm Platzbedarf ist so einfach, daß sie auch ohne Hilfe großer Instrumentenfirmen verfügbar wird. Inzwischen wurde ein erstes Internet-Buch zur µ-PLC (englisch) mit vielen Abbildungen veröffentlicht <-- Clicke hier.  Könner könnten aus den Abbildungen sehen, wie man ohne Hilfe Dritter vorankommt.

Hier ein erstes Bild zum µ-PLC “instrument” :      

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An drei Aluminium-Stutzen liegt eine 100 x 100 mm dicke Abdeck-Glasplatte an - die µ-PLC Deckplatte mit einem 5 mm Loch exakt im Zentrum . Die HPTLC Alu-Platte Kieselegl 60 F254 liegt unter der Deckplatte, jedoch in einem Abstand von 1 mm, der durch die vier kleinen Glasplättchen in den Ecken der Deckplatte bewirkt wird. Dadurch entsteht eine “virtuelle PLC-Kammer”, gefüllt mit Luft - oder, wenn das µ-PLC-System in einer PE-Wanne liegt - gefüllt mit dem Gas, das in der Wanne vorherrscht, zB CO2.
Die HPTLC-Platte ist mit einem Klebestreifen - rechts oben im Bild - positionsfest mit der µ-PLC Arbeitsplatte verbunden. Auf diesem Streifen kann ein Analytik-Kenncode stehen. Links am Bildrand erkennt man einen Teil einer Libelle. Diese - fest verbunden mit der Arbeitsplatte - muss für eine streng waagrechte Position des Systems sorgen. Das erfordert die nach allen Seiten offene “virtuelle” PLC- (Gas)-Kammer. Sonst würden spezifisch schwere Gas-Dampfgemische unsymmetrisch abfliessen. Rechts im Bild oberhalb der Deckplatte ist ein Griff zu sehen, welcher die Glasplatte und damit das Phasenzufuhrsystem in Position und Lage zu bringen hilft. Das “Phasenzufuhrsystem” ist eine 1.5 ml Glasflasche, die mit einem Docht durch das zentrale Deckplattenloch mit der HPTLC-Schicht durch flüssig-Kontakt verbunden ist. Es fliesst mit auf besser +-1 % konstantem Fluss die mobile Phase in die HPTLC-Schicht. Unterschiedliche Dichten, Viskositäten und die Benetzungsfreude der Schicht stellen den Fluss automatisch so ein, sodass nichts überfließt. Dieser Effekt war dem Erfinder eine ganz unerwartete Überraschung und hat so das µ-PLC System rasch und breit einsetzbar gemacht.

Das “handling” ist einfach - siehe diese zwei Bilder unten

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Das “Phasenzufuhrsystem” sieht einfach aus, aber da bedarf es einiger Präzision:

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Links ist die Docht enthaltende Verschraubung fertig für einen Trennlauf, falls das Dochtvolumen mit strömendem Gas trocken geblasen wurde. Rechts ist oben ein 5 mm o.d. 3 mm i.d. PTFE Schlauchstück zu sehen, das den gerollten Docht aus Baumwolle-Flies enthält. Die Fläschchen plus Verschluss-Schraube werden in Apotheken für Arzneimittelzubereitungen eingesetzt. Alle Materialien erwiesen sich als chemisch stabil gegen übliche mobile Standardphasen. Der Flaschenverschluss hält z.B. Methylenchlorid mindestens über Jahresfrist dicht in dem 1.5 ml Apothekenfläschchen. Diese sind über das Internet zu beziehen.

Dosieren, Entfernen flüchtiger Lösemittel, Fokussieren, Entfernen der Fokussierflüssigkeit und Trennbeginn folgen rasch aufeinander und sind ausgesprochen einfach.
Dabei werden auch gröbste lokale Positionsfehler korrigiert, wie die Folge der drei Abbildungen unten zeigt.

       Dosieren (Positionsfehler)   Fokussieren (exakt aus Zentrum)     Beginn der Trennung

Die Dosierung kann jedoch auch lokal sehr Präzise vorgenommen werden. Die obigen Abbildungen sollen lediglich eine der vielen guten Eigenschaften der Fokussiertechnik zeigen. Wie eine präzisere Dosierung aussieht, ist weiter unten abgebildet.

Dosierdetails - stets mit nachfolgender Fokussierung.

Wie schon erwähnt gilt als elegantestes Dosierwerkzeug für die µ-PLC der Kunstmaler Mikropinsel Er ist vegleichbar mit einem Bündel offener Kapillaren, ist also leicht memory-frei zu reinigen und zeigt keine Probleme mit unlöslichen festen Partikelchen. Im Mörser zerkleinerte Proben können Feststoffe enthalten, die in DC-Lösemitteln unlöslich sind. Strichdosierer mit teuren Präzisionsspritzen sind damit sofort überfordert. Die Anwendung von Mini-Filtrationstechniken wie bei der Probenvorbereitung für fast alle eindimensionalen Chromatographietechniken erforderlich können systematische Probenverfälschungen bewirken und kosten Zeit, Instrumente und somit ständig viel Geld. Wir haben nicht glauben können, dass man mit kleinen Pinseln quantitativ arbeiten kann. Die Fakten haben aber überzeugt. Verwendet wurden die Pinselgrößen 00, 1, 3, 5 und 6. Für bestimmte Tests zur Ermittelung optimaler Phasenmischungen sind größere Pinsel zweckmäßig. Die Wiederholbarkeit des Dosiervolumens lag dann bei +- 2% .

Links unten im Bild sind die gefundenen Pinsel-Dosierdaten abgebildet sowie die zugehörigen Fokussierbilder. Rechts ist zur Korrektur eines möglichen falschen Eindrucks über “schlampige” Dosierung gezeigt, dass sehr wohl auch ohne Instrumente örtlich präzise genug dosiert werden kann. Im rechten Bild steht die Fokussierung noch aus. Optimal ist es, erst in Kreise, dann aus dem Zentrum in Bögen zu dosieren, falls die Chromatogramme quantitativ ausgewertet werden sollen. Für die Hauptanwendung der µ-PLC, nämlich kritische Produktvergleiche, ist diese Doppelfokussierung überflüssig.
 

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Die Pr-Werte sind zwar ungleich zu jenen bei linearer Technik aber können umgerechnet und so quantitativ verglichen werden, falls die linearen Pr-Wert frei von systematischen Fehlern sind.

In der circularen Technik ist die Probenfokussierung somit elegant anwendbar. Sie ist fundamental wichtig. Die µ-PLC benutzt als Gasphase (Luft - CO2 - N2 ) mit einem konstanten Fluss von etwa 2 L/min aus einer Mini-Gaspumpe. Das Gas strömt in bzw. auf das Zentrum der Platte, siehe das Bild oben links. Grundsätzlich vermieden wird jede Art Heißluft z.B. aus einem Fön. Sie würde die PLC durch Temperaturstürze qualitativ ruinieren, weil die Platte auf einer festen Unterlage liegt, die Wärme halten würde. Quantitativ leiden viele Stoffe unter einem Heißluft-Fön, der eine schlimme Folge von systematischen Fehlern auslöst aber trotzdem fast “regulierter Standard” in der TLC und HPTLC ist.

Die wie beschrieben optimierte Zentralfokussierung erscheint aufwändig. Das ist nicht richtig. Deswegen soll hier erweitert beschrieben werden, was damit für die Datenqualität der PLC gewonnen wird wobei der Autor um Nachsicht für Wiederholungen bittet. Diskussionen mit Fachkollegen ergaben, dass eine in der Planar-Chromatographie ausgesprochen unterentwickelte bis unbekannte Nachbehandlung der Dosierung zunächst nur schlecht einzusehen ist. Man verließ sich in der Vergangenheit eher auf Trennplatten mit einem speziellen kaum sorbierenden Plattenstreifen. Der hat jedoch trotzdem memory-Eigenschaften gezeigt. Er wäre für die circulare µ-PLC auch unbrauchbar. Eine Mehrheit von Fachkollegen setzt auf die instrumentelle Strichdosierung. Diese hat zahlreiche Nachteile, die aber hier nicht zu behandeln sind. Auch eine technisch durchaus mögliche instrumentelle Kreisbogendosierung um das Plattenzentrum herum würde in der Hauptsache nur Kosten bringen aber die Vorteile der einfachen oder doppelten Fokussierung nicht bieten.

Eine optimale und technisch richtige Fokussierung hat diese wertvollen Folgen :

µ-PLC ist deutlich trennschärfer als TLC / HPTLC.
Durch strömendes Gas wird das Probenlösemittel vollständig entfernt, was die Chromatographie streng nach den benutzen Trennphasen ablaufen läßt.
Die so lösemittelfreie Probe wird auf einen scharfen Startring fokussiert. Häufig wird dadurch eine Trennschärfe erreicht, die mit der einer 100 mm langen klassisch gepackten HPLC Säule vergleichbar ist.
Die Fokussierung erfolgt mit einer mobilen Phase, welche alle Probenbestandteile an die Front der Fokussierphase bringt.
Wasser spielt dabei eine entscheidende Rolle. Die lokale Wasserkonzentration wird auf einen optimal tiefen und in der Schicht homogen gleichwertigen Wert gebracht, der aber von totaler Trockenheit weit genug weg gehalten werden muss. Eine Mindestmenge Wasser ist für die PLC auf Adsorptionsplatten fast bei allen Trennaufgaben wichtig. Das klassische “Aktivieren” in einem heißen (??) Trockenschrank ist wegen der sekundenschnellen Änderung des Wassergehaltes - total inhomogen in Bezug auf Schichttiefe - an der Laborluft plus Atemluft je nach Stress im Labor mehr Wunschdenken als Fakt und unabhängig von aller Regulierung und Zertifizierung schlicht unqualifiziert.

Und das sind die Vorteile von strömendem Gas bei Raumtemperatur und Fokussierung:

Keine Trennverfälschung durch Probenlösemittel
Keine Trennverschlechterung durch die unvermeidbare und ungezielt circulare Vor Chromatographie mit lokaler Verdrängung beim Auftragen von Probenlösungen.
Perfekte Startposition für alle Probenbestandteile - was eine Voraussetzung für präzise qualitative Chromatographiedaten ist. Pr-Werte in der µ-PLC können mitunter auf besser
als +- 0.01 Einheiten Vergleichsstandardabweichung gebracht werden

Beachte: je schärfer die Startbögen, um so richtiger sind die quantitativen Analysenwerte - quantitative µ-PLC-Werte können bis herunter auf +- 0.05 % Vergleichsstandardwerte reproduziert werden - siehe die Seite “quantitative µ-PLC”.

Zwischenbemerkung: Die gerade genannten quantitativen Präzisionswerte sind in der Planar-Chromatographie global unbekannt. Man kann sie nicht glauben oder muss sich genau ansehen, warum die µ-PLC solche Werte liefern kann und welcher Aufwand - oder welche Konzepte - dazu nötig sind. Natürlich ist es ganz leicht möglich, mit µ-PLC auch die bekannt schlechten Pr-Werte und die für moderne Pharmaanalytik katastrophalen Wiederholstandardabweichungen von mitunter +- 5% zu produzieren.
Mancherorts  sind allerdings Präzisionswerte deutlich besser als +- 5 oder bestenfalls +- 3% ausgesprochen unerwünscht. Ein qualifizierter Analytiker, der weiss, dass alle anschliessenden Entscheidungen nur so richtig und scharf sein können,  wie die Analysendaten, ist für eine solche Politik nicht verfügbar.

Hiweis: Als die Kapillar-Gas-Chromatographie klassische 1 - 3 m lange gepackte Trennsäulen  ablöste und plötzlich die bislang sieben Verunreinigungen siebzehn Stoffe ausmachten, war der Ärger mitunter groß: es war ja offensichtlich bisher fast alles falsch: qualitativ wie quantitativ. ABER NUR mit verbesserter Trennung konnten Probleme wirklich gelöst, Schäden oder produktbezogene Gefahren wirklich erkannt und nötige Fortschritte wirklich gemacht werden.
Die Totaltrennung in tausende von Probenanteilen wird heute stellenweise noch angestrebt, aber ist ein Irrweg. Eine optimale Reduktion von analytischer Information auf das Umsetzbare ist die Kunst. Der Vorteil der Planar-Chromatographie ist die Kraft der hundert selektiven Detektionsverfahren. Dies sei hier bemerkt um darauf hinzuweisen, dass Mikro bei der µ-PLC nicht heißt, es würden Detektionsmethoden behindert werden. Die Platte ist nach wie vor ein unersetzbarer Datenspeicher.
Auch MS ist bei der µ-PLC möglich, sofern dazu die RICHTIGE Technik eingesetzt wird, welche ohne flüssige Extraktionsmittel auskommt.

Nachruf als Frage:
wer bitteschön dosiert denn heute noch per Hand ?

Antwort:
der nur wenige Proben - z.B. zwei bis drei  pro Tag, Stunde, Platte oder Phasengemisch untersucht.

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okdos

Das Zentrum der Platte und das Zentrum der schließlich fokussierten Proben müssen sehr präzise festgelegt und beibehalten werden, auch wenn die Platte aus welchen Gründen auch immer während der chromatographischen Arbeit - zB Bedampfen, Belichten etc. - von der Arbeitsplatte zwischendurch entfernt werden muss. Wieder-Einlegen gelingt auf +- 0.1 mm in X und Y durch vollständiges Anlegen an die drei Aluminiumstutzen und erneutem Fixieren mit einem Klebebandstreifen. Genau so präzise ist auch die Glasdeckplatte und somit das Phasen- und Gas-Zufuhrloch in der Glasplatte in Position gebracht. Es kann genau fokussiert werden, indem man z.B. mit einem Mikropinsel Nr. 6 etwa 15 Mikroliter Fokussierflüssigkeit durch die Zentralbohrung aufbringt. Muss wegen anschliessender quantitativer Auswertung jedoch sehr präzise zentral fokussiert werden, kann mit einem PTFE-Rohr 5 mm o.d. und 1.6 mm i.d. eine Glas Mikropipette mit 20 µl Fokussierflüssigkeit präzise in das Plattenzentrum aufgesetzt werden. Das PTFE-Rohr wird mit einem Abstandsring in das Zentralloch eingesetzt, aber die Schichtoberfläche der Platte wird  davon gerade nicht berührt. Die “Einmal-Mikropipette mit Ringmarke” hat einen Außendurchmesser von 1.5 mm und ist am Ausgang mit einer Mikroflamme ein wenig verengt worden. Dadurch fließt die Fokussierflüssigkeit optimal. Klingt kompliziert, ist aber einfach. Bild links unten zeigt das Trocknen der perfekt fokussierten Proben aus Bild rechts oben. Bild rechts unten zeigt das dann anlaufende Chromatogramm. Das Fokussierzentrum ist in der Digitalphotographie scharf sichtbar, wichtig für die anschliessende Auswertung per software im Bereich Pr-Wert-Erfassung.

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Kritischer Hinweis:
Der Autor stimmt einem TOP Fachkollegen zu, welcher die Chromatographie von der Kapillar-GC über alle Varianten der HPLC bis zu allen Bereichen der Planar-Chromatographie beherrscht. Er wendet sie  für industrielle und nationale Großaufträge genau so wie für die Forschung seit zig Jahren an. Die Elektrochromatographie hat er wie die modernsten Varianten der Planar-Chromatographie maßgeblich mit- und weiterentwickelt. Er schrieb auch die zugehörigen softwaren selbst. Er schrieb mir in englisch - und um den Sachverhalt streng richtig zu halten, wird auf eine Übersetzung verzichtet: ... nobody is willing to do more than can be obtained from instrument and its software. Instead to think how to improve the possibilities of some technique they are moving to another one. Mostly it is column separation where you can see nothing critical, and if yo do not see problems than there is no problem. People are not coming any more on seminars even they are free. Only regulatory affairs and to get certificates from the producer. In this case main approaches (and progress) are not understood.....

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