Was ist µ-PLC ? Was ist das Besondere ?

Eine neue dünnschicht-chromatographische Kontroll- und Analysenmethode mit folgenden Haupt-  Eigenschaften:

- maximal kostenreduziert

- minimaler Platz-, Material- und Energiebedarf

- damit ist die µ-PLC die erste “grüne” HPTLC. Was “grüne Chromatographie” generell ist: Miniaturisierung
   reduzierter Phasenverbrauch; Minimierung oder Vermeidung toxischer Hilfsstoffe; Minimierung von
   Energieverbrauch; Optimierung von Informationsgewinnung und -Verwertung.

- quantitativ mit bisher nicht erreichter Präzision durch weitgehende Beseitigung der Plattenstruktur.
  Gegenüber auch noch so teuerer instrumenteller HPTLC um den Faktor zehn schärfer reproduzierbar,
  ausgedrückt als Vergleichsstandardabweichung.

- auch ohne quantitative Auswertung einsetzbar beim Vergleich von Produkten, wobei auch bei fehlender
   Quantifizierung ein bisher in der Analytik unbekannter Qualitätsbegriff gilt: ein absolut sicheres Urteil bei
   klar sichtbaren UNTERSCHIEDEN zu vergleichender Proben. Das Besondere dabei war eine unerwartete
   Erkenntnis - siehe unten in ROT.


- µ-PLC ist die erste wirklich PLANARE Chromatographie. Der Autor trägt allerdings mit Verantwortung, dass
   TLC, OPLC, HPTLC-Methoden auch zur Planar-Chromatographie gerechnet werden. 

   Die linearen TLC-, OPLC-, HPTLC- Methoden mit linear nebeneinander laufenden durch Leerbahnen
   begrenzten Chromatogrammen benutzen NICHT die analytische Kraft der wirklich planaren Chromato-
   graphie. Die  µ-PLC ist die erste wirklich PLANARE Dünnschicht-Analysentechnik, wenn sie bei Vergleichs-
   analysen die Proben circular partiell überlappen lässt. In diesem Bereich sind alle Bedingungen gleich:
   Temperatur, Polarität, Fluss, und so weiter. Dann (und nur dann) ist die Chemie und Physik für die 
   Analyse   beider Proben identisch.
   Erst dieser analytische Zustand garantiert den sicheren qualitativ-analytischen Vergleich. Notwendig dabei
   ist jedoch, dass auch die Probenlösemittel von A und Q vollständig entfernt wurden und die Proben in
   etwa mit gleichen absoluten Mengen pro Bogenlänge auf die gleiche Startringposition fokussiert wurden,  
   ehe nach wieder völliger symmetrischer Trocknung die Trennung aus dem Plattenzentrum gestartet wird.

   Klingt aufwändig ? Wird aber mit der oben beschriebenen bisher nicht erreichbaren Ergebnissicherheit
   belohnt. Keine HPLC- oder GC-Trernnung, auch keine multidimensionale, bietet Vergleichbares, da deren
  Trennsysteme schon nach jeder Dosierung stofflich fast immer nicht mehr das Gleiche sind wie vorher.

-  µ-PLC ist HPLC- und GC-kompatibel. Ein 1 ml grosses HPLC-Peakvolumen kann zu 100% auf die PLC-Platte
   dosiert und zu einem scharfen Ring fokussiert werden, bevor getrennt wird.

-  Wenn MS-Identifizierungen gebraucht werden: kein Problem: MS weiss nicht, dass hier µ-PLC vorliegt.
   Nur muss die richtige DC <-- MS Kopplungstechnik (Desorption in der Gasphase) eingesetzt werden.

Gasphasen-kontrolliert. Die Platte wird mit strömendem Gas (2 L/min) drucklos und isotherm getrocknet,
   nachdem sie mit geeigneter mobiler Phase circular gereinigt wurde. Dabei kann sie mit Spuren polarer
   Stoffe zur Trennoptimierung vorimprägniert werden. Das Gas ist Laborluft, getrocknete Laborluft (mit
   Trockner in der Gaszufuhrleitung) oder CO2, N2 etc. zugeführt mit einer Gaspumpe, wie sie auch in
   Aquarien verwendet wird. Extrem sicher, 24 Stunden stabil, ausgesprochen ökonomisch und elegant.

Die mobile(n) Phase(n) werden durch ein Phasenzufuhrsystem mit konstantem Fluss zugeführt - richtiger: die Platte saugt sich so viel Phase unter konstanten Flussbedingungen aus einem 1.5 ml Phasenfläschchen, wie sie gerade ohne Überlauf akzeptiert. Das ist technisch-chromatographische Kooperation, die der Autor anfangs selbst nicht glauben wollte, so elegant geht das. Weiterer Vorteil: die mobile Phase erfährt nicht die geringste stoffliche Rückwirkung von der Plattenoberfläche, wird also auch nicht verändert. Das garantiert eine perfekte stoffliche Reproduzierbarkeit, vorausgesetzt, der Analytiker kann eine 1.5 ml Phasenflasche fehlerfrei beschicken und kennt die Probleme von Flüssigkeits-Memory in 500 Mikroliter Präzisionsspritzen. Und er hat mobile HPTLC-Qualitätsphasen. (Hat er in der Regel ohne eine Destillationsreinigung aus Paraffinphase nicht, wenn er dies nicht mit µ-PLC Massendosierung auf einer reinen Testplatte vorher geprüft hat, denn zu häufig sind mobile Chromatographie-Phasen nur von HPLC-Qualität, also UV-rein, aber nicht rückstandsfrei.)

Die µ-PLC hat den technisch weitesten quantitativen Dosierbereich: von Nanolitern (aus Mikrokapillar-
Dosierern) bis zu Millilitern (aus dem Phasenzufuhrsystem, das nun als Probenquelle ins Plattenzentrum gesetzt wird, wonach das Probenlösemittel durch stetig strömendes Gas unmittelbar und langsam = schonend - verdampft, siehe die zugehörige Abbildung im µ-PLC report 2008 in dieser SITE.

Die µ-PLC ist eine GC- und HPLC-POP Kontrollmethode. POP heisst “purity of peak”. POP wird in Mol- oder Gewichtsprozent gemessen. Man lässt exakt nur einen Peak auf die PLC Platte strömen oder dosieren und vermeidet jede Spur von memory. Ist der Wert von POP nicht  100%, dann besteht der so geprüfte Peak aus mehr als einem Stoff. Damit sind die qualitativen und quantitativen GC-bzw. HPLC-Daten systematisch falsch.

Inzwischen haben tausende von Fachkollegen - und analytisch Interessierte - das µ-PLC-Buch angeclickt. Sie kommen aus über 60 Ländern. Das spricht dafür, dass folgende Besonderheit dieser  Analysentechnik interessiert. Sie kann mit Folgendem verständlich gemacht werden:

Alle regulierten - zertifizierten und alle freien Analysenmethoden, die nacheinander Probe für Probe abarbeiten, funktionieren nacheinander. Da hat sich also die Zeit von Analyse zu Analyse geändert, und mit ihr möglicherweise eine oder verschiednene Temperaturen, Drücke, Flüsse und alles, was eben mit der Zeit geht. Zum Beispiel die chemische Zusammensetzung im Einlass eines Trennsystems, oder auf den vorderen Flächen der stationären Phase. Das chromatographisch Unbewegliche bleibt dort sitzen und wirkt - als systematisch geänderte stationäre Phase - bei der nächsten Analyse mit. Man erkennt dies an der Wiederholstandardabweichung. Sie ist nie null und gilt für die Abweichungen von über 60 % der Messungen. Will man Daten mit 95%iger Sicherheit haben, dann ist etwa die dreifache Wiederholstandardabweichung der Bereich, in welchem die analytischen Werte schwanken. Mit 5 % Sicherheit sind die Werte noch viel breiter gestreut und somit schon mehr oder weniger falsch oder unbrauchbar.

Analysiert man nebeneinander - zB parallel auf Dünnschichtplatten - dann ist zwar kein Zeiteffekt Grund für Schwankungen, aber sehr stark wirksam die lokale Plattenstruktur, jede Art stofflicher Gradient, Inhomogenitäten usw - alles Gründe für eine große Vergleichsstandardabweichung. Sie liegt für quantitative Werte in der heutigen HPTLC für Pharmaprodukte im Bereich von +- 5 % und optimal bei 2 bis 1 %, obwohl Chromatographie bis zu einen Präzisions-Spitzenwert von +- 0.002 % technisch wiederholbar möglich ist. Also nebeneinander ist noch unsicherer als hintereinander.

Und “ineinander” ? In dem Dreiecksbereich auf dem zirkularen µ-PL-Chromatgramm Bild unten Ende Text
ist die Zeit für die Vergleichsanalyse von teilweise ‘ineinander dosierten und ineinander laufenden’ Proben und Trennungen exakt gleich. Die Physik der Trennung ist exakt gleich. Die Chemie - alle Feinheiten der mobilen und stationären Phase sind für beide Probenanteile exakt gleich - es läuft eben ‘ineinander’. Und so folgt, dass es keine Wiederhol- oder Vergleichsstandardabweichung gibt - wohl allerdings ist eine Vergleichsstandardabweichung bestimmbar in den jeweiligen ‘nebeneinander’ liegenden Probenanteilen - das sind die Substanzbögen ausserhalb der Ineinanderposition - siehe das genannte letzte Bild unten. Mit Multi-Integration kann je ein Grad Winkel eine Vierfach-Quantifizierung erfolgen - siehe unter Multiintegration im µ-PLC-Buch (engl). Es lohnt sich, über die Analytik im ‘Ineinander-Bereich’ nachzudenken und warum dort 100 % Ergebnis-Sicherheit existiert, wenn sich Unterschiede erkennen lassen. Mit tausenden von mobilen Phasen, zig Detektiermethoden und vielen Gasreaktionen auf den entsprechenden Plattenbereich in der
µ-PLC ist ganz außerodentlich viel analytisch erreichbar und eben erstmals in der Analytik fehlerfrei - natürlich richtiger Umgang mit Proben vorausgesetzt.

Was µ-PLC NICHT ist :

Die Methode ist nicht für Wissenschaftler geeignet, die sich schämen würden, eine extrem preiswerte und gar nicht vollautomatische Präzisionsanalysenmethode anzuwenden. Oder die niemals mehr Proben manuell dosieren würden. Oder bei denen es nicht um die Sicherung von Produktänderungen oder Produktunterschieden geht, z.B. begründet durch Alterung, neue oder geänderte Vorschriften, geänderte oder unsichere Produkt-Quellen, geänderte Vertriebswege.

Es gibt viele weitere Probleme, welche die Sicherung von Qualität betreffen  und eine intelligente Analytik verlangen, bei der es nicht allein um computerisierte Graugeräte mit nur einem START-Knopf geht - welche allerdings ein hohes Ansehen auslösen könnten bei Jenen, welche auch von stofflicher Analytik keine Ahnung haben. In deren Firmenwerbung aber zunehmend  steht: “Sie müssen nur noch EINEN Knopf drücken. Es sind keinerlei besondere Fach-Kenntnisse erforderlich”

µ-PLC erfordert leider richtige Chromatographiekenntnisse, sogar HPTLC-Können und vor allem  Erfahrungen über das richtige Erkennen des stofflichen Problems, der richtigen Wahl von Art, Ort, Zeit und Dichte der Probennahme, der analytisch richtigen Probenvor- und -Aufbereitung, der systematisch richtigen Dosierung, Trocknung, Fokussierung, Trennung und Detektion, der richtigen Aus- und Bewertung und den richtigen Aktivitäten aufgrund gesicherter Resultate. Da könnte es schnell passieren, dass plötzlich Richtiges getan werden muss, obwohl es vor jeglicher Analyse noch so aussah, als ob “kein Handlungsbedarf” bestünde.

µ-PLC ist keine Massen-Screening-Methode. Aber wenn man auf Trennungen verzichten kann, indem man aus dem Fundus der hundert verschiedenen HPTLC- Detektionsmethoden die Richtigen wählt, kann mit den µ-PLC-Dosiermethoden eine 100 x 200 mm HPTLC-Platte mit mindesten 400 Proben quantitativ auf etwa +-2...3 % Vergleichsstandardabweichung dosiert werden und so Screeninganalytik erfolgt. Die ist dann extrem kostengünstig.
 

Was kann µ-PLC (noch) nicht ?

Die Methode ist (noch) nicht roboterisiert, aber ihr Konzept ist dafür perfekt geeignet. Sie braucht keine über 200 mm hohe mobile Phasentröge mit Elektronik für Überlaufsicherung etc., denn µ-PLC hat gar keine Phasenkammer. Richtiger: sie hat nur eine virtuelle Phasenkammer von 1 mm Höhe. Dafür muss die HPTLC-Platte aber streng vertikal im Lot liegen.
Hinweis: die Phasenzufuhrflasche hat ein Volumen von 1.5 ml. 1 ml ist jedoch das optimale Atrbeitsvolumen.
 

Wie funktioniert µ-PLC, wie sieht die hardware aus und woher bekommt man software?

Das Konzept wird aus Abbildungen im µ-PLC report 2008 (english) erkennbar. Eine genaue Beschreibung der nötigen Werkzeuge und die Adressen von Bezugsquellen für Teile des “µ-PLC-Instruments” finden Sie, allerdings in englisch in www.planar-chromatography-by-kaiser.com

Die Quantifizier-software gibt es über  www.sorbfil.com (es handelt sich um eine Gemeinschaftsentwicklung von IfC & Sorbfil). Die Dosierpinsel bekommt man in gut sortierten Papierfachgeschäften. Auf Pinselqualität muss geachtet werden. Das Grundbrett kann durch Schnitt in Möbelläden gefunden werden, die ALU-Griffe kann man sich aus 10 mm Rundmaterial schneiden lassen - aber Vorsicht: das Verkleben von Metall mit Glas durch UV-aktivierte Kleber erfordert Reinheit, Präzision. und eine UV-Lampe. Der Autor missbrauchte dazu die CAMAG-UV-Lampe.

Das Gesamtgerät ist so einfach zusammengestellt, dass die Angaben in dieser SITE ausreichen werden, ein System rasch funktionsfähig zu machen. Es könnte dann auch - z.B. - zur Analyse von Wasser auf Trinkbarkeit geeignet sein. Immerhin liegt die untere Nachweisgrenzkonzentration mit einer oder einigen der hundert HPTLC-Detektionsmethoden bei 10-9 Gramm pro 100 Gramm Wasserprobe, die man mit 1 ml geeigneten Lösemittel extrahiert. Dieses 1 ml-Extrakt wird voll dosiert.

Über die Proben- und Plattenvorbereitung, die fokussierte Circulardosierung und dadurch erhöhte Trennkraft der µ-PLC, über die sehr einfache Mitverwendung der “dritten Phase” = Gasphase, die sehr einfache selbsttätige Phasenzufuhr mit automatisch sich einstellenden kontanten Fluss, die optimale Trocknung und die Foto-Quantifizierung sowie über das ausgesprochen einfache “Instrument” wird in den folgenden Monaten berichtet.

Was ist das Besondere ?
Wenn man zwei zu vergleichende Proben untersucht, und man erreicht, die Dosierung, Fokussierung und Trennung so vorzunehmen, dass in einem bestimmten Sektor der Platte nach der Trennung sich die beiden Chromatogramme partiell überlappen, dann entsteht im Überlappungsbereich eine ganz besonderer analytischer Zustand. Den gibt es bei keiner anderen analytischen Methode.  Dieser spezielle analytische Zustand ist methodisch definitiv einmalig und besagt:

1. Die Zeit, bei der die Trennung lief, ist für beide Proben exakt gleich, anders als z.B.in GC oder HPLC,
    bei der eine Probe nach der anderen analysiert wird und inzwischen allerhand passiert sein kann.
2. Alle physikalischen Zustände wie Druck, Fluss, Temperatur, Konzentrationen und absolute Massen
    aller Phasenbestandteile sind EXAKT gleich für die partiell überlappten Chromatogramme
3. Alle chemischen Eigenschaften bis hinunter zu den niedrigsten Spuren sind exakt gleich für
    beide Proben im Überlappungsbereich. Wie ein Überlappungsbereich aussieht zeigt das rechte
    Planar-Chromatogramm im ersten Bild des englischsprachigen Berichts zur µ-PLC 2008 in dieser Site.Das Chromatogramm im Bild unten besitzt drei Überlappungsbereiche: im Sektor 2, 4 und 7.

Schlussfolgerung:
Diese totale zeitliche, stoffliche und physikalische Zustandsgleichheit für die Analytik der zwei zu vergleichenden Proben führt dazu, dass es keine auch noch so geringe Gefahr für unterschiedliche systematische Fehler gibt. Die eine Probe sei eine authentische Probe, die zweite eine “fragliche”.
Somit gilt, was sonst in der stofflichen Analytik unmöglich ist: wenn sich die beiden Proben unter-
scheiden, dann sind sie ungleich mit 100%iger Sicherheit. Entweder hat sich in der Serien- oder
Badge-Produktion etwas verändert, oder die eine Probe hat sich durch Alterung oder andere Einflüsse
verändert, oder die beiden Proben sind ungleich egal was wer behauptet, oder nur die eine Probe ist
authentisch und die andere gefälscht oder der Vertragspartner für eine Zusatzproduktionskapazität
kann eben doch nicht die gleiche Produktqualität erreichen. Das ist in allen Fällen ärgerlich aber gerichtsfest.

Was ist µ-PLC und was ist sie nicht,
 was kann die Methode, was kann sie (noch ?) nicht, wie funktioniert sie.

Der Aufbau einer Anlage ist ausgesprochen einfach, aber die software ist anspruchsvoll. 
Sie ist via Internet beziehbar. Diese SITE zeigt ein VIDEO.
 

Inzwischen wurde das erste Internet-Buch zur Planar-Chromatographie freigegeben.
 Es ist erreichbar über diesen CLICK
: µ-PLC

fig.REK

µ-Planar-Chromatogramm mit vier Proben, die sich im Sektor 2, 4 und 7 überlappen.
Angeblich sollen die Stoffe  im Sektor 3, 5 und 6 exakt gleichen Proben entsprechen.
Es ist völlig zweifelsfrei zu sehen, dass die drei Proben sich deutlich unterscheiden. Man könnte annehmen, dass die Probe im Sektor 6 einer stark verdünnten Probe 5 entspricht. Wenn aber gesichert ist, dass das Produkt 5 exakt genau so wie das Produkt 6 zu streng gleichartigen Probenlösungen mit genau gleichen Gewichten im gleichen Probenlösungsmittel hergestellt wurde - das kann jeder Analytiker, weil die Probennahme -Probenvorbereitung und Probengabe seit mehr als hundert Jahren zum Mindestkönnen herangereift ist - dann also haben die Produkte zu 3, 5 und 6 nichts miteinander zu tun. Dass 3 nicht 5 sein kann, ist offensichtlich. Sektor 4 ist ein Überlappungsbereich.

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